牛血清白蛋白鉴别方法
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牛血清白蛋白篇1
【关键词】 对苯二酚
蛋白质是生物体的基本组成成分,如酶、抗体、转运蛋白等在生物体内发挥着重要功能。人血清白蛋白存在于血液中,分子量为66241,等电点为47〔1〕,主要维持血浆的胶体渗透压,其另一功能是与许多微溶于水的物质结合为易溶于水的复合物。酚类化合物对DNA有不同程度的损害〔2-5〕,对苯二酚在环境中容易氧化为对苯二醌,对苯二酚与对苯二醌可以和DNA碱基形成加合物〔6-8〕,对人体危害极大。对苯二酚与对苯二醌是通过人血清白蛋白转运进入人体各器官。因此,研究血清白蛋白与对苯二酚与对苯二醌的相互作用具有重要意义。本文利用循环伏安法研究了对苯二酚在L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂上的电化学行为,并初步探讨了在L舶腚装彼嵘吓Q清白蛋白与对苯二酚及对苯二醌相互作用的机制。
1 材料与方法
11 仪器与试剂 缓冲液:005mol/L Na2HPO4-005mol/L NaH2PO4-010mol/L NaCl缓冲溶液(用NaOH调pH);005g/L L舶腚装彼幔01mol/LH2SO4;20000g/L对苯二酚。200000g/L牛血清白蛋白。MEC-12B型多功能微机电化学分析仪(江苏电分析仪器厂);金电极(直径1mm)为工作电极,铂电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极。
12 实验方法
121 L舶腚装彼嵩诮鸬缂上组装 将金电极在置于005μmAl2O3粉末中反复抛光至镜面,用Microcloth抛光布抛光光亮,再用丙酮冲洗,用亚沸水超声波清洗。将金电极置于01mol/LH2SO4中于2V氧化5s,-035~15V于1V/s循环扫描5次,取出金电极,用蒸馏水冲洗干净,用磁力搅拌器在蒸馏水中清洗5min,将清洁后的金电极置于50g/L L舶腚装彼峤泡24h,取出金电极,用蒸馏水冲洗干净,用磁力搅拌器在蒸馏水中清洗5min,即得L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂。所用水为3次亚沸蒸馏水。
122 电化学行为 在500ml容量瓶中,加入010ml对苯二酚,500ml 005mol/L Na2HPO4-015mol/L NaCl缓冲溶液,混匀,作循环伏安扫描。
13 量子化学计算 对苯二酚与对苯二醌用半经验方法(AM1)进行分子几何构型初始优化,然后用密度泛函理论(DFT)在6-31G(d)水平进行全优化分子结构,在相同水平计算分子的分子前线轨道能量及静电荷。用Gaussian03软件完成所有计算。
2 结果
21 L舶腚装彼嵝奘蔚缂的电化学行为特征(图1) 由修饰电极于-060~08V范围内的循环伏安图可见,裸金电极上未见氧化还原峰存在;L舶腚装彼嵝奘蔚缂在高电位的电流增大,溶液pH=730时,在-0068V产生一个氧化峰,这可能是羧基在较低的电位下被还原为羟基所致。
22 对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为(图2,表1) 从表1可见,在L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂上,当溶液pH=730时,氧化峰(Epa)比裸金电极负移了0169V,还原峰(Epc)比裸金电极负移了0061V,对苯二酚在L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂可逆性变好,峰电流变大,对对苯二酚的氧化还原具有催化作用。结果与杜丹等人研究对苯二酚在L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂上的电化学行为一致〔9〕。当溶液pH=1100时,在L搽装彼嵝奘谓鸬缂上的氧化峰比裸金电极正移了0090V,还原峰比裸金电极负移了0010V,说明在【【微信】】时,对苯二酚在L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂可逆性变坏,峰电流变小,对对苯二酚的氧化还原不具有催化作用。
表1 对苯二酚在L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂及裸金电极上的电化学参数(略)
23 扫速对对苯二酚峰电流和峰电位的影响 对苯二酚在裸金电极上的氧化还原峰电位随着扫速的增大氧化峰电位发生正移,还原峰负移,峰电流(ip)与扫速的平方根(V1/2)成正比,说明峰电流受扩散控制;对苯二酚在L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂上的氧化还原峰电位受扫速的影响与裸金电极相似,峰电流(ip)与扫速的平方根(V1/2)成正比,说明峰电流也受扩散控制。
a,a`:裸金电极;b,b`:L舶腚装彼嵝奘蔚缂;扫描速度:100mv/s
图1 L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂上的循环伏安图(略)
a,a`:00400g/L对苯二酚在裸金电极上;b,b`:00400g/L对苯二酚在L舶腚装彼嵝奘蔚缂上;扫描速度:100mv/s
图2 对苯二酚在L舶腚装彼嵝奘谓鸬缂上和裸金电极上的循环伏安图(略)
24 牛血清白蛋白对峰电位与电流的影响(图3) 由于牛血清白蛋白容易吸附到金电极上,故在修饰电极上研究了牛血清白蛋白在pH=730溶液中对对苯二酚氧化还原电位及电流的影响。从图3可见,牛血清白蛋白加入到对苯二酚溶液时,其氧化峰电位发生负移,但峰电流改变不大,说明牛血清白蛋白对对苯二酚向电极扩散的影响较小;而对其氧化产物对苯二醌,其氧化峰电位发生负移,峰电流变小,说明牛血清白蛋白对对苯二醌的扩散的影响较大。当牛血清白蛋白的浓度达到05000g/L时,峰电位不再改变,说明牛血清白蛋白与对苯二酚结合达到饱和状态。当牛血清白蛋白的浓度达到12000g/L时,峰电流不再改变,说明牛血清白蛋白与对苯二醌结合达到饱和状态。根据苯二酚和对苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量,计算苯二酚和对苯二醌和血清白蛋白结合比分别为48:1和16:1。
转贴于
a:00400g/L对苯二酚;b:00400g/L(15800g/L)牛血清白蛋白;pH=730;扫描速度:100mv/s
图3 牛血清白蛋白对苯二氧化还原电位及电流的影响(略)
25 对苯二酚现对苯二醌的量子化学计算结果 对苯二酚与对苯二醌所有原子都在一个平面内,对苯二醌的最大净电荷为043,最小的负电荷为-045,最低空轨道和最高占有轨道能量分别为-012999和-027059Hartree,分子的偶极距为0,为非极性分子;分子的净电荷反映了分子间净电吸引的能力;最低空轨道能量越低,越容易接受电子,最高占有轨道能量越高越容易提供电子,分子的前线轨道反映了形成分子氢键的能力,故对苯二酚较对苯二醌容易提供电子,而对苯二醌较对苯二酚容易接受电子。由此来看,对苯二醌比对苯二酚具有较大的净电吸引的能力和形成分子氢键的能力,因而在电极上峰电位和峰电流改变较大。
3 讨论
结果表明,在pH1100时主要以NH2-C(R)OO存在。具有较好催化活性的基团为NH3-C(R)OO-。苯酚的pKa1=1000时,主要以苯酚分子的形式存在,而对苯二酚的羟基是供电子基团,故pKa1
参考文献
〔1〕 张昌颖.生物化学[M].2版.北京:人民卫生出版社,1985:432.
〔2〕 宋远志.对苯二酚与脱氧核糖核酸的相互作用[J].中国公共卫生,2006,22(2):192-194.
〔3〕 宋远志.苯酚与脱氧核糖核酸的相互作用[J].中国公共卫生,2005,21(12):113-114.
〔4〕 宋远志.对硝基苯酚与杂交中DNA的相互作用[J].中国公共卫生,2005,21(1):33-35.
〔5〕 宋远志.邻氨基酚与脱氧核糖核酸的相互作用[J].中国公共卫生,2005,21(9):94-96.
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〔7〕 Margaret Gaskell,Rebekah Jukes,Donald J.L.Jones.Identification and Characterization of(3,4-Dihydroxy)-1,N2-benzetheno-2-deoxyguanosine 3-Monophosphate,a No【【微信】】 Benzene Metabolites[J].Chem Res Toxicol,2002,15:1088-1095.
〔8〕 Margaret Gaskell,Keith I E McLuckie,Peter B.Farmer.Genotoxicity of the benzene metabolites para-benzo【【微信】】 and hydro【【微信】】[J].Chemico-Biological Interactions,2005,153(1):267-270.
牛血清白蛋白篇2
[关键词] 牛血清白蛋白;生物色谱柱;阿司匹林
[中图分类号] R96[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2014)06(a)-0101-04
Preparation of bo【【微信】】ogical chromatographic column and its application in determination of Aspirin
TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1
1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.【【微信】】, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China
[Abstract] Objecti【【微信】】l chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized acti【【微信】】, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detecti【【微信】】 combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of abo【【微信】】 stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.
[Key words] Bo【【微信】】; Biological chromatographic column; Aspirin
牛血清白蛋白色谱柱的制备
及对阿司匹林的
1.广西医科大学公共卫生学院,广西南宁 530021;2.广西医科大学第一附属医院药学部,广西南宁 530021
[摘要] 目的 制备生物色谱柱,用于分离或测定药物成分。 方法 采用3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)与硅胶反应生成氨基功能化的活化硅胶,并与牛血清蛋白(BSA)共价结合形成BSA键合固定相,匀浆装柱制备成BSA生物色谱柱,以阿司匹林(Aspirin,ASP)为分析对象考察BSA固定相的结合性能和分离性能。 结果 BSA结合率为3.69 μmol/g,ASP在BSA键合固定相色谱柱上的最大结合量为74 mg/g,经BSA色谱柱测得阿司匹林肠溶片的含量为14.65 μg/片,标示量为107.8%。 结论 这表明BSA与硅胶载体成功结合形成BSA键合固定相,所制备的BSA生物色谱柱具有良好的结合性能与分离性能。
[关键词] 牛血清白蛋白;生物色谱柱;阿司匹林
[中图分类号] R96[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2014)06(a)-0101-04
Preparation of bo【【微信】】ogical chromatographic column and its application in determination of Aspirin
TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1
1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.【【微信】】, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China
[Abstract] Objecti【【微信】】l chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized acti【【微信】】, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detecti【【微信】】 combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of abo【【微信】】 stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.
[Key words] Bo【【微信】】; Biological chromatographic column; Aspirin分子生物色谱法(MBC)是20世纪80年代中后期逐渐发展起来的以酶、受体、抗体、传输蛋白等生物大分子为固定相的一类色谱法,是基于生物大分子的特异性相互作用原理进行分离纯化具有活性的化合物或测定生化参数的一项新兴技术[1]。药物作为一类重要的生物活性物质与血浆蛋白存在可逆性的结合平衡,药物分子通过血浆白蛋白的运输到达受体部位发生药理作用,而药物分子在体内与血浆蛋白的相互作用是其发挥药理作用的前提,因此可以通过血浆白蛋白生物色谱筛选药物中的活性成分。付强等[2]通过自制人血清白蛋白色谱柱成功对DL(±)色氨酸进行了手性分离;Bentucci等[3]制备出的血清白蛋白色谱柱,不仅可筛选出药物活性成分,还可通过体外实验反映药物-血清白蛋白的相互作用。蔡汉宁等[4]制备出核心组蛋白色谱柱作用于其活性物质,至少筛选出9种组蛋白作用蛋白。与传统的实验方法相比,分子生物色谱法具有高度专一性、分离速度更快、容易自动化操作、重复性好等优点[5]。
由于人血清白蛋白价格昂贵,用于制备生物色谱柱成本太高,有学者利用牛血清白蛋白与人血清白蛋白结构相似的特点,制备成牛血清白蛋白色谱柱用于中药活性成分的分离测定。Tan等[6]通过制备的牛血清蛋白生物整体柱,成功的分离出当归的活性成分,并考察了当归提取液在该整体柱上保留的影响。本文主要通过将硅胶氨基功能化与BSA共价键结合合成BSA固定相,制备BSA生物色谱柱,并选择了阿司匹林(ASP)作为与BSA结合的对象来验证BSA色谱柱的性能。ASP作为一种代表性药物,不仅具有卓越的消炎、退热、止痛能力,研究表明它还可以协同干扰素抑制肝细胞癌生长转移[7],抑制宫颈癌Hela细胞增殖[8],预防妊娠期高血压[9]等。通过对ASP及其肠溶片的分离测定,可以进一步探讨生物色谱柱在药物有效成分分离测定中的应用前景。
1 仪器与材料
6010紫外可见分光度计(安捷伦科技公司,上海);LC-10Tvp高效液相色谱仪(日本岛津公司);spectrum 100傅立叶变换红外光谱仪(美国penkim Elmer仪器有限公司);Bio-Rad垂直电泳槽、电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)(97%,上海晶纯试剂有限公司,批号:15122);N,N′-琥珀酰亚胺碳酸酯(98%,阿拉丁公司,批号:25231);考马斯亮蓝G250(沃凯,批号:WB【【QQ微信】】);BSA(【【微信】】);硅胶Sepra Silica (粒径50 μm,phenomenex 美国);ASP标准品(Purity>99%);ASP肠溶片(50 mg/片,国药准字H43021814);四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺溶液、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、Tris碱、甘氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)均来自北京索莱宝。
2 方法与结果
2.1 BSA色谱柱的制备
取硅胶2 g(平均粒径为50 μm,孔径46 Å(1 Å=0.1 nm),比表面积为518 m2/g),加入适量甲苯回流除去残留水分,按10 μmol/m2加入3-氨丙基三甲基硅烷反应8 h得到氨丙基硅胶,过滤,分别用甲苯和甲醇洗涤,真空干燥后置干燥器保存。取氨丙基硅胶2 g,加入乙腈5 mL和N,N′-琥珀酰亚胺碳酸酯2 g,于30℃反应24 h,过滤后分别用乙腈、甲醇洗涤得到活化硅胶。取制备得的活性硅胶1.5 g,加入到25 mmol/L(pH=6.6)的磷酸盐缓冲液中,再加入适量BSA,30℃下搅拌反应20 h,过滤后依次用水及5%乙醇多次洗涤,得到BSA固定相。将制备好的BSA固定相用缓冲液匀浆后注入不锈钢柱(4.5 nm×150 nm)中,并抽真空压紧柱,制备得到BSA色谱柱。
2.2 傅里叶红外光谱(FTIR)验证活化硅胶功能基团
用溴化钾压片法制备活化硅胶样品,进行FTIR分析。FTIR分析结果见图1,硅胶(a)和活化硅胶(b)共有的吸收峰有:1099、1103 cm-1处的非对称伸缩振动,指纹区800 cm-1的对称伸缩振动和470 cm-1的弯曲振动,均为硅胶的主要结构Si-O的特征谱带;与硅胶(a)相比,活化硅胶(b)增加了伯胺(-NH2)的吸收峰1402、1561 cm-1,2928 cm-1峰为亚甲基的不对称变形振动峰,说明硅胶上中有亚甲基的存在,表明APTS已结合在硅胶上。由此可见,活化硅胶成功连接上了氨基功能基团。
a.硅胶;b.活化硅胶
图1 硅胶和活化硅胶的红外光谱图
2.3 BSA与活化硅胶结合量
按硅胶与BSA质量比8∶1、4∶1、2∶1、1∶1进行表面覆盖率的测定。称取四份硅胶,每份0.5000 g,分别与0.0625、0.1251、0.2500、0.5000 g BSA反应,反应结束后各取100 μL洗涤液采用考马斯亮蓝染色法[10]测定其中BSA含量,用BSA加入量与反应剩余BSA量之差计算出结合量,按照下列公式计算出BSA的表面覆盖率:表面覆盖率=结合蛋白的物质的量(μmol)/活化硅胶质量(g)。结果显示,活化硅胶与BSA质量比为4∶1时,BSA结合量已基本达到饱和,加大剂量并不能明显的增加键合量,表明BSA表面覆盖率可能受空间位阻大小的影响。见图2。
图2 活化硅胶与BSA不同配比下的BSA表面覆盖率
2.4 BSA固定相结合ASP研究
精密称取ASP对照品50 mg,用冰醋酸-甲醇(1∶10)溶液稀释至50 mL,摇匀,得到ASP标准溶液。取ASP标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL用冰醋酸-甲醇(1∶10)溶液稀释至10 mL,各取10 μL用于HPLC。色谱条件:流动相:甲醇-20%冰醋酸(3∶1);流速:1 mL/min;色谱柱:C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:30℃;紫外检测器,λ=237 nm。得到ASP标准曲线方程:Y=97 941X+ 37 178,r=0.9997,其中Y为峰面积,X为ASP浓度(μg/μL)。
称取一定量的硅胶和BSA固定相匀浆法分别填装于两根柱子中,精密称定适量的ASP,用中性乙醇溶解后缓缓倾注入色谱柱中,用蒸馏水洗涤柱子,接收洗涤液,根据标准曲线计算洗脱液中ASP含量,ASP加入量与洗脱液中ASP含量之差得到固定相对ASP的结合量,见图3。对比硅胶固定相和BSA固定相对ASP的结合量,ASP与BSA固定相结合量明显大于与硅胶固定相结合量,证明与ASP结合的主要是BSA而不是硅胶。
图3 硅胶固定相、BSA固定相与阿司匹林结合量的比较
2.5 BSA色谱柱性能考察
牛血清白蛋白篇3
[摘要] 目的 探讨小牛血清去蛋白提取物对放射性肠炎的防治作用,寻找能够有效防治各种放射性黏膜损伤的理想药物。 方法 将Ⅱ、Ⅲ期盆腔肿瘤患者108例随机分成观察组和对照组各54例,观察组行放疗+小牛血清去蛋白提取物保留灌肠,对照组行放疗+地塞米松等药物保留灌肠,观察两组相关血清和临床指标在治疗前后的变化。 结果 在疗程内,随着时间的推移,C反应蛋白(CRP)的水平不断升高,观察组的CRP增长速度慢于对照组(P<0.05);与对照组相比,观察组能显著延长首次直肠临床症状的发生时间;放疗结束后,观察组总有效率为81.48%,显著高于对照组的59.26%,差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论 小牛血清去蛋白提取物可有效调节CRP水平,减轻放疗所致的直肠黏膜免疫损伤,推迟直肠黏膜炎症的发生时间。
[关键词]盆腔肿瘤;小牛血清去蛋白提取物;放射性肠炎;C-反应蛋白
[中图分类号] R574 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616(2013)16-15-03
盆腔、腹腔、腹膜后肿瘤,尤其是妇科肿瘤及前列腺肿瘤是最常见的恶性肿瘤,放射治疗已经成为恶性肿瘤综合治疗过程中一个不可缺少的重要环节。但放疗中常常出现累及小肠、结肠和直肠的放射性肠炎(radiation enteritis,RE)。据流行病学不完全统计,目前我国放射性肠炎发生
吃素的人和爱吃肉的人哪个更长寿 爱吃肉和爱吃素的人谁会更长寿
吃素和吃肉对比,吃素的还是吃肉的,吃肉与吃素的性格区别有人喜欢吃素,减肥的人、寺庙和尚、信佛之人等;有人喜爱吃肉,儿童、胃口大的人。对于吃素的人,更能够吸收蔬菜中的维生素含量,对于补充身体维生素是有好处的。
对于吃肉的人,能够补充肌肉力量,增强体质。总之,无论是吃素的蔬菜还是荤荤的肉类,都能为身体带来一定好处,那么对于吃肉和吃素的人来说,哪个更长寿呢?有没有影响呢?不妨了解下!